我真不是醫(yī)二代 772.反向輸出

?結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大常見癌癥，平均5年總生存率（OS）為60。原發(fā)性CRC可通過手術(shù)治愈；然而，在轉(zhuǎn)移階段，OS顯著降低。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）中，患者接受治療性手術(shù)或圍手術(shù)期或姑息性化療和靶向治療。

?在診斷時(shí)，20–30的患者患有同步肝轉(zhuǎn)移（LM），所有CRC患者中的50–75會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致死亡的主要原因。為了提高OS，我們需要進(jìn)一步了解mCRC并確定其他治療靶點(diǎn)。雖然臨床前研究集中在原發(fā)腫瘤（pTU）和轉(zhuǎn)移過程，但臨床挑戰(zhàn)在于轉(zhuǎn)移患者的最佳治療。此外，沒有常用的免疫活性動(dòng)物模型重現(xiàn)CRCpTU和轉(zhuǎn)移的生長，使得我們對(duì)于了解轉(zhuǎn)移性CRC充滿挑戰(zhàn)。

?腫瘤細(xì)胞在復(fù)雜的微環(huán)境中生長，涉及驅(qū)動(dòng)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。組織力學(xué)特性的變化既可以先于疾病發(fā)展，也可以推動(dòng)疾病發(fā)展，腫瘤“硬度”與幾種腫瘤類型的預(yù)后相關(guān)。先前的研究表明，包括乳腺癌和胰腺導(dǎo)管腺癌在內(nèi)的幾種實(shí)體瘤的疾病進(jìn)展與其彈性模量相關(guān)。

?組織剛度是組織抵抗變形的程度，由應(yīng)力和應(yīng)變之間的關(guān)系描述。在組織水平上，剛度受細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的控制。纖維狀膠原蛋白是最豐富的ECM支架蛋白，對(duì)組織剛度有顯著影響。富含膠原蛋白I（COLI）的異常ECM重構(gòu)已被確定為癌癥進(jìn)展過程中組織硬化的主要原因。作為ECM的主要來源，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）通過表達(dá)賴氨酰氧化酶（LOX）來進(jìn)一步改變腫瘤機(jī)械環(huán)境，賴氨酰氧化酶是一種胺氧化酶，可啟動(dòng)膠原蛋白的共價(jià)內(nèi)和分子間交聯(lián)過程。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校ㄟ^LOX抑制來抑制基質(zhì)硬化可改善腫瘤生長并改善治療。因此，CAF被認(rèn)為是限制癌癥進(jìn)展的有希望的治療靶點(diǎn)。

?腫瘤微環(huán)境在為腫瘤提供血液供應(yīng)方面也起著關(guān)鍵作用。通過使用單克隆抗體、VEGF陷阱或多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑靶向血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路來抑制mCRC血管生成。目前，療效不足和耐藥性限制了抗血管生成療法的益處。此外，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）根據(jù)機(jī)械環(huán)境調(diào)節(jié)其屏障能力和生長。具體而言，堅(jiān)硬的基質(zhì)促進(jìn)EC增殖并可能導(dǎo)致血管完整性缺陷，這表明機(jī)械環(huán)境可能會(huì)影響腫瘤中的EC行為，從而影響抗VEGF的功效.本研究旨在闡明轉(zhuǎn)移性血管生成是否受機(jī)械微環(huán)境的影響，機(jī)械微環(huán)境可以通過mCRC中轉(zhuǎn)移相關(guān)的成纖維細(xì)胞（MAF）激活進(jìn)行調(diào)節(jié)，以及是否可以改變這種MAF激活以提高抗血管生成治療的療效。

1、CRC中的MAF高度激活

?在LM中觀察到aSMA、pMLC2和COLI的顯著更高表達(dá)，表明MAF的肌成纖維細(xì)胞和ECM重塑特征。

?接下來，從CRC患者的和中分離出原代成纖維細(xì)胞。MAF顯示出aSMA和pMLC2的顯著上調(diào)，證實(shí)了肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞收縮性信號(hào)的增加。FAs的量化顯示MAFs中FAs的平均面積更大（圖L和M），支持CRCMAFs被高度激活。

2、晚期CRC患者的ECM重構(gòu)和硬化特征

?為了鑒定與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)特征，我們對(duì)CRC患者的pTU和LM進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNAseq）。使用通路相互作用數(shù)據(jù)庫(PID)對(duì)LM中上調(diào)基因進(jìn)行的基因集分析(GSA)揭示了整合素信號(hào)傳導(dǎo)的顯著富集。為了進(jìn)一步表征成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)，我們?cè)诔晒Ω患髮?duì)分離的原代CAF和MAF進(jìn)行了RNAseq。

?我們鑒定了3，721個(gè)差異表達(dá)的基因。GO確定了MAF中上調(diào)的肌成纖維細(xì)胞ECM重塑特征。KEGG確定了ECM受體相互作用和FA特征和PID確定了整合素信號(hào)（圖H）。此外，基因集富集分析(GSEA)還揭示了差異表達(dá)基因的肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞收縮、FA、ECM成分、肌生成和血管生成特征的強(qiáng)烈富集（圖IM）。

3、MAFs增加微環(huán)境硬度，支持血管生成

?我們進(jìn)行了凝膠重塑分析，并觀察到MAF顯示出更密集、更復(fù)雜的F肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)（圖A），并且可以比CAF更大程度地收縮凝膠（圖B）。在新鮮和冷凍保存的組織中，我們觀察到LM的基質(zhì)硬度顯著增加（圖CD）。基質(zhì)硬度與來自同一患者的樣本中的COLI、aSMA和pMLC2表達(dá)相關(guān)（圖EG）。

?基質(zhì)硬化調(diào)節(jié)EC增殖、血管生成、血管生長和分支，為了研究這種聯(lián)系，我們?cè)u(píng)估了LM中的脈管系統(tǒng)，并觀察了基質(zhì)硬度和CD31血管面積之間的相關(guān)性（圖H）。當(dāng)在凝膠內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，允許成纖維細(xì)胞重塑基質(zhì)，MAFs誘導(dǎo)EC發(fā)芽的程度顯著高于CAFs（圖IK）。因此，MAF支持伴隨局部ECM重塑的細(xì)胞因子產(chǎn)生血管生成。

4、腎素血管緊張素系統(tǒng)抑制目標(biāo)成纖維細(xì)胞

?對(duì)新鮮分離的MAF與肝源性成纖維細(xì)胞的qPCR分析顯示RAS系統(tǒng)的所有關(guān)鍵成分（血管緊張素原[AGT]、腎素

EN]、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶[ACE]和AT1[AGTR1]的表達(dá)顯著增加）。此外，MAFs表達(dá)的AGT和AGTR1水平顯著高于CAFs（圖LO）。為了表征RAS靶向?qū)AF功能的影響，我們?cè)谟寐壬程梗ㄒ环NAT1阻滯劑）或卡托普利（一種ACE抑制劑）治療后進(jìn)行了凝膠收縮試驗(yàn)。在低濃度（氯沙坦為1mM，卡托普利為5mM）和高濃度（氯沙坦為10mM，卡托普利為50mM）時(shí)，兩者都顯著降低了MAF凝膠收縮（圖PR）。

5、RAS抑制降低轉(zhuǎn)移基質(zhì)硬度并重塑微環(huán)境

?與無高血壓組和非RAS治療組2相比，接受抗RAS藥物治療的患者組織硬度顯著降低（圖AB）。進(jìn)一步評(píng)估（通過對(duì)同一患者組中的COL1、aSMA和pMLC2染色）是否可以通過MAF激活的下調(diào)來解釋轉(zhuǎn)移剛度的差異。雖然高血壓與pMLC2染色的增加相關(guān)，但我們沒有觀察到對(duì)aSMA和COLI的影響（圖CH）。在所有組中，抗RAS治療顯示MAF激活和ECM沉積顯著減少（圖CH）。抗RAS藥物的作用獨(dú)立于特定的RAS抑制治療。觀察到轉(zhuǎn)移僵硬（不同條件±高血壓±抗RAS藥物）與COLI、aSMA和pMLC2表達(dá)之間呈正相關(guān)（圖IK），表明MAF激活水平有助于組織僵硬在LM。總之，接受抗RAS治療的患者顯示出低肌成纖維細(xì)胞ECM特征，這解釋了轉(zhuǎn)移硬化的減少。

6、AT1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過RhoA介導(dǎo)MAF激活

?接下來，作者想確定RAS抑制如何導(dǎo)致MAF激活減少。體外用氯沙坦或卡托普利處理MAF表明LOX和COL1A1mRNA表達(dá)降低（圖AB）。pMLC2在RAS抑制后也顯著減少（圖CD）。氯沙坦和卡托普利治療顯著降低了ARHGEF1的酪氨酸磷酸化，并導(dǎo)致活性RhoA減少（圖EH）。類似地，ARHGEF1的敲低導(dǎo)致pMLC2減少，支持血管緊張素ARHGEF1RhoA軸在MAF中的作用（圖IJ）。總的來說，我們結(jié)果表明RAS通路抑制劑通過抑制MAF主動(dòng)收縮（圖K）以及減少膠原蛋白生成和交聯(lián)來阻止基質(zhì)硬化，從而改善腫瘤纖維化過程。

7、RAS抑制增加了貝伐單抗的抗血管生成作用

?基質(zhì)硬度不受單獨(dú)貝伐單抗治療的影響（圖AB）。在Bev組中，與非RAS治療的高血壓患者和無高血壓患者相比，抗RAS治療導(dǎo)致組織硬度降低（圖A，C）。類似地，在Bev組中，在抗RAS治療的患者中也觀察到了相同的基質(zhì)硬度降低（所有p＜）（圖A，D）。此外，抗RAS治療組的硬度降低與特定治療無關(guān)。單獨(dú)的貝伐單抗治療不影響LM內(nèi)的COLI、aSMA和pMLC2。為了評(píng)估抗血管生成治療（貝伐珠單抗治療）和RAS抑制對(duì)血管系統(tǒng)的綜合影響，我們測(cè)量了一大群CRCLM中的血管密度。與Bev組相比，Bev組的血管密度顯著降低了48.7±8.2。然而，與非RAS、Bev治療相比以及與所有Bev組。這與使用的RAS治療類型無關(guān)。因此，抗RAS藥物靶向組織硬度，從而影響貝伐單抗的療效。

8、通過RAS和血管生成抑制減少EC增殖

?EC增殖隨硬度增加而增加，VEGF進(jìn)一步誘導(dǎo)增殖，低硬度時(shí)VEGF效應(yīng)最高（圖AC）。此外，我們分析了在不同密度的纖維蛋白原基質(zhì)（剛度的代表）中存在或不存在VEGF的情況下EC發(fā)芽。EC發(fā)芽（芽的數(shù)量和長度）隨密度增加。VEGF導(dǎo)致在所有條件下進(jìn)一步發(fā)芽，VEGF在軟基質(zhì)中的作用更顯著，如EC增殖的情況。

?為了了解抗RAS藥物和貝伐單抗的組合如何影響轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的EC，我們量化了它們對(duì)EC增殖的影響。單獨(dú)的貝伐單抗治療導(dǎo)致EC增殖減少56.1±11.0。由于轉(zhuǎn)移僵硬與獨(dú)立于治療的轉(zhuǎn)移內(nèi)的EC增殖相關(guān)，我們?cè)u(píng)估了RAS抑制是否足以減少EC增殖。在未接受抗血管生成治療的患者中，RAS抑制并未顯著降低EC增殖；然而，在接受貝伐單抗和抗RAS藥物治療的患者中，EC增殖進(jìn)一步降低了78.1±9.2）。

9、RAS和血管生成抑制改善血管完整性

?有趣的是，VEGF和基質(zhì)硬化都有效地導(dǎo)致血管通透性。為了進(jìn)一步表征抗RAS藥物對(duì)血管完整性的作用，我們通過對(duì)緊密連接蛋白ZO1（封閉小帶1）進(jìn)行免疫染色分析了它們對(duì)EC連接穩(wěn)定性的影響。雖然建議貝伐單抗治療導(dǎo)致消除未成熟血管，但我們觀察到貝伐單抗對(duì)ZO1緊密連接沒有變化（圖AB）。與之前在其他疾病模型中的發(fā)現(xiàn)一致，即增加基質(zhì)剛度可增強(qiáng)內(nèi)皮通透性，我們還觀察到ZO1覆蓋率與CRCLM的組織硬度之間存在負(fù)相關(guān)，表明在更硬的。在接受抗RAS藥物治療的Bev患者中，我們還觀察到EC中ZO1覆蓋率的增加，表明單獨(dú)的抗RAS足以改善內(nèi)皮連接穩(wěn)定性（圖A，D）。然而，在聯(lián)合治療（Bev和抗RAS）中，對(duì)連接穩(wěn)定性的影響大大增強(qiáng)（圖A，E）。

?KLF2是一種剪切應(yīng)力響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)隨層流剪切應(yīng)力增加，是灌注的標(biāo)志。抗血管生成治療沒有改變內(nèi)皮細(xì)胞中KLF2的表達(dá)（圖FG）。然而，KLF2表達(dá)與組織剛度呈負(fù)相關(guān)，表明基質(zhì)硬度增加會(huì)損害灌注（圖H）。在未接受貝伐珠單抗治療的患者中，KLF2表達(dá)未因抗RAS治療而改變（圖FI），但在抗RAS和貝伐單抗治療的患者中顯著更高（圖F、J）。

10、內(nèi)皮細(xì)胞YAPTAZ是受LM基質(zhì)硬度和VEGF調(diào)節(jié)的中樞

?然后我們使用EC核標(biāo)記ERG1分析了患者樣本中的ECYAPTAZ激活狀態(tài)。抗血管生成治療導(dǎo)致YAPTAZEC硬度降低（圖K，L），表明VEGF信號(hào)是LM中EC中YAPTAZ易位所必需的。然而，與非高血壓患者以及接受貝伐珠單抗和非RAS藥物治療的患者相比，貝伐珠單抗治療同時(shí)停用VEGF的同時(shí)降低僵硬度降低了核YAPTAZ強(qiáng)度（圖K，N），與RAS抑制的類型無關(guān)。最相關(guān)的是，我們觀察到接受LM切除術(shù)并在疾病過程中接受抗血管生成治療并同時(shí)進(jìn)行抗RAS治療的患者的OS顯著延長。這通過多變量Cox回歸分析得到證實(shí)（圖O）。綜上所述，抗血管生成治療聯(lián)合RAS抑制顯著抑制內(nèi)皮YAPTAZ激活和轉(zhuǎn)移性血管生成。

?研究優(yōu)點(diǎn)：

①腫瘤受到其微環(huán)境的機(jī)械特性的影響。利用患者樣本和原子力顯微鏡，我們發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移瘤的組織硬度高于原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤。高度活化的轉(zhuǎn)移相關(guān)成纖維細(xì)胞增加了組織的硬度，從而增強(qiáng)了血管生成和抗血管生成治療的抵抗力。

②針對(duì)腎素血管緊張素系統(tǒng)的藥物通常用于治療高血壓，可抑制成纖維細(xì)胞收縮和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而減少肝轉(zhuǎn)移瘤硬化，并增加貝伐單抗的抗血管生成作用。

③接受貝伐單抗治療的患者在同時(shí)接受腎素血管緊張素抑制劑治療時(shí)存活時(shí)間延長，這突顯了調(diào)節(jié)治療方案的機(jī)械微環(huán)境的重要性。

?研究局限性：

①對(duì)于接受貝伐單抗治療的結(jié)直腸癌和肺癌患者，貝伐單抗治療本身就能誘發(fā)高血壓。在該研究中并未對(duì)與貝伐單抗無關(guān)的高血壓及貝伐單抗導(dǎo)致的高血壓進(jìn)行區(qū)分。