我真不是醫(yī)二代 774.敵人的敵人就是朋友

對59例EGFR突變的晚期NSCLC患者的腫瘤活檢標本進行了檢測，這些患者以前在1G/2GTKI上經(jīng)歷過PD。在38例(63)患者中檢測到EGFRT790M。1G/2GTKI的中位TTP為10.3個月(范圍為1.375.8個月)，T790M組和T790M組分別為7.4月和13.6個月(HR，1.64;95CI，0.952.83;P0.07;補充圖S5)。在T790M和T790M組之間，之前接受治療的情況沒有差異，包括作為最后線治療的EGFRTKI(65.8vs.61.9，P0.76)、以前使用過化療(76vs.66，P0.75，檢驗)，或化療暴露的持續(xù)時間(平均215天vs.175天，P0.75)。與以前的報告一致，顯微鏡下的組織學轉(zhuǎn)化是罕見的，一例鱗狀轉(zhuǎn)化(A450)和另一例混合腺癌小細胞組織學(A092)在基線和耐藥后都觀察到了。

T790M和T790M疾病狀態(tài)的基因組圖譜

我們首先評估了我們隊列中的體細胞基因組改變（除EGFRT790M外）與38例晚期EGFR突變非小細胞肺癌患者的治療初期隊列（WES數(shù)據(jù)）的患病率差異。TP53SNV改變在TKI耐藥人群（63）中比治療初期人群（45）更為普遍。此外，我們檢測到與治療初期腫瘤相比，治療耐藥腫瘤中TERT和編碼于14q22的三個基因（PTGDR、SAV1和SOS2）的基因組擴增率總體較低。接下來，通過比較T790M和T790M，我們試圖確定先前報道的并確定潛在的新的治療可處理耐藥機制抗TKI的樣品。5例（8）患者出現(xiàn)MET改變，主要發(fā)生在T790M患者隊列。在一名患者（A056）中，檢測到導致MET外顯子14跳躍（METex14）的剪接位點缺失，外顯子14處的轉(zhuǎn)錄缺失通過RNAseq數(shù)據(jù)驗證。該患者還表現(xiàn)出染色體臂7p缺失（EGFR突變?nèi)笔В┖?2q擴增（包含MDM2和CDK4，通常用METex14擴增）。同樣，我們沒有在另一名T790M患者中檢測到原發(fā)性外顯子19缺失/L858R突變（A058），表明失去激活EGFR突變是獲得性耐藥真正罕見的機制。PIK3CA突變（n10，17）和HER2擴增（n4，7）是常見的，但基于T790M狀態(tài)沒有差異（分別為P0.69和P0.54），盡管耐藥腫瘤中PIK3CA改變的頻率（17）總體上高于晚期治療未經(jīng)EGFR突變腫瘤的患者（5，P0.09）。在PIK3CA突變中，值得注意的是，大多數(shù)是克隆的（n5/7），并且由ClinVar注釋為可能致病的（n6/7）綜上所述，這表明PI3K信號在介導TKI抵抗中的作用獨立于T790M狀態(tài)。鑒于KEAP1和NFE2L2共突變在產(chǎn)生治療抵抗中的潛在作用。然而，我們沒有在隊列中檢測到任何NFE2L2突變，我們只在T790M腫瘤（A449）中檢測到一個KEAP1突變。

TP53改變是在大約一半的EGFR突變的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的早期克隆事件。與T790M患者相比，T790M患者TP53基因突變顯著豐富(86vs.50，P0.01)，其中大部分(n36/37，97)為早期克隆事件(n36/37，97)，與T790M患者相比差異有顯著性(P0.01)。此外，MDM2和YEATS4擴增在T790M患者中更為常見，且與TP53突變互斥(P0.004)。這兩個基因位于同一染色體位置，負調(diào)控TP53。正如我們和其他人以前報道的，已知的癌癥驅(qū)動基因突變的數(shù)量越多，多變量分析的Ttp越短(HR，1.41；95CI，1.091.81；P0.008；補充圖S8A)。特別是，并發(fā)的RB1/TP53改變(n5)與T790M狀態(tài)無關(guān)的TTP密切相關(guān)，與最近的一份報告一致。

拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，WGD是常見的，與治療初期EGFR突變腫瘤中觀察到的比率(88vs.89)相當。然而，在7名(12)沒有WGD的患者中，所有人都是T790M(嵌入圖像測試，P0.04)，并且有EGFR外顯子19的缺失，這表明WGD的缺失預示著T790M耐藥疾病的出現(xiàn)。在T790M和T790M腫瘤之間，基因組不穩(wěn)定指數(shù)(Gii；中位數(shù)分別為52和55)沒有差異，也沒

有發(fā)現(xiàn)TP53共突變與Gii增加相關(guān)。T790M患者的腫瘤突變負荷高于T790M患者(TMB中位數(shù)為2.36vs.1.66個突變/Mb，P0.02，圖1C；補充圖1C、S9A)，可能是由于T790M隊列中的吸煙者數(shù)量較多

接下來，我們檢查了T790M患者3q23(包含PIK3CB、MRAS和FOXL2等基因)和T790M患者14q21(包含F(xiàn)OXA1和NKX21)與T790M狀態(tài)揭示擴增相關(guān)的反復焦點擴增和缺失事件(補充圖S10)。值得注意的是，3QARM擴增在T790M組(57)高于T790M組(13)，并且是唯一有統(tǒng)計學意義的ARM水平事件(圖1E，EmbeddedImageTESTP≤0.001)。我們證實了染色體3Q基因(包括SOX2)在3Q臂增加的患者中有較高的表達(補充圖S11C)。為了了解TKI治療后這些染色體水平改變可能獲得的程度，我們再次與治療前的隊列進行了比較。在治療初始隊列中，38例中有7例(18)出現(xiàn)了3Q增加(補充圖S3)腫瘤。這一結(jié)果明顯低于T790M(P0.003)，但與T790M患者相似(P0.53)，提示3Q擴增可能是T790M腫瘤特異獲得的。有趣的是，染色體3Q含有鱗狀細胞系轉(zhuǎn)錄因子TP63和SOX2，是肺鱗狀細胞癌的主要特征，但以前與肺腺癌無關(guān)。

接下來，我們研究了與EGFRTKI耐藥相關(guān)的突變過程。在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了公認的突變特征，即衰老、APOBEC、DNA雙鏈斷裂修復、吸煙和DNA錯配修復。與T790M相比，EGFRT790M耐藥腫瘤對衰老信號的相對貢獻率更高，這與EGFRT790M點突變的三核苷酸背景下AG的最高概率核苷酸變化一致(補充圖3S12和S13)。相反，與T790M腫瘤相比，非衰老特征(吸煙、載脂蛋白BEC和DNA修復)在T790M中的比例顯著高于T790M腫瘤，暗示了驅(qū)動T790M抗性的另一種突變過程。總體而言，這表明T790M耐藥性可能不太可能出現(xiàn)在具有較大比例的活躍的非衰老突變特征(例如吸煙/APOBEC特征)的腫瘤中。

我們使用WES數(shù)據(jù)估計了每個腫瘤樣本的癌細胞比例(純度)，并使用轉(zhuǎn)錄組去卷積方法Tumera估計和比較了T790M和T790M腫瘤中癌癥和間質(zhì)(非惡性)細胞中的基因表達。值得注意的是，我們推測在T790M腫瘤的癌細胞中，肺腺癌標志基因如NAPSA、NKX21、SFTA2和SFTA3的表達普遍且?guī)缀跬耆珕适А４送猓覀冇^察到鱗狀細胞癌或神經(jīng)內(nèi)分泌癌的組織學標志基因在一小部分T790M腫瘤中的表達增加(n4，27。這些發(fā)現(xiàn)得到了多重免疫熒光的正交驗證，證實了與T790M腫瘤相比，T790M癌細胞中NAPSA和NKX21(TTF1)的表達降低(圖2D；補充圖S14)。值得注意的是，對三個未接受治療的NSCLC腺癌隊列的分析表明，低腺癌標志物基因(NAPSA和NKX21)的表達非常罕見，僅在EGFR野生型腫瘤中觀察到(圖2F)。總而言之，這些數(shù)據(jù)突顯了TKI耐藥后獲得性譜系可塑性以前被低估的程度，特別是在T790M腫瘤中，與3Q擴增和非衰老突變簽名過程共存，潛在地促進了表皮生長因子受體獨立的信號機制。谷

鑒于檢查點抑制劑在EGFR突變的NSCLC中缺乏療效，我們試圖描述與EGFRTKI耐藥相關(guān)的免疫環(huán)境，最初根據(jù)“T細胞炎癥基因表達譜”(GEP)特征對腫瘤進行分層。

然后，我們使用了一種已發(fā)表的計算方法(TEDER；REF)進一步闡明與TKI耐藥相關(guān)的浸潤免疫細胞亞群。這表明，與免疫T790M腫瘤相比，免疫T790M中MDSCs的推測水平更高(P0.04，t檢驗)，而TAMM2的水平更低(P0.003，t檢驗)。免疫T790M中PDL1、FOXP3和IDO的表達也顯著高于免疫T790M腫瘤(圖3B，PDL1和FOXP3多重免疫熒光染色見附圖S15B和S15C)。接下來，我們調(diào)查了耐藥時的免疫表型是否與之前1G/2GTKI的持續(xù)時間有關(guān)。有趣的是，免疫T790M腫瘤的總TTP最短(圖3C)，其中一半(5/10名患者

)的總TTP小于3個月。相反，免疫T790M腫瘤的總生存期最長(中位TTP20.6個月；范圍8.2月至76.8月)，與免疫冷藏T790M腫瘤相比(中位TTP4.1月；范圍1.3月至13月；心率11.78；P0.004；95CI3.01月46.2月；P0.001；圖3C)。Meta分析強調(diào)單劑免疫檢查點抑制劑在EGFR突變的非小細胞肺癌(59例)、7/8(88，4/8熱、2/8冷、2/8未知)患者中缺乏療效，這與Meta分析一致(補充表S5)。然而，一名免疫T790M患者(A096)在臨床試驗中接受了nivolumabipilimumab免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合治療(60例)，并獲得了8.9個月的穩(wěn)定病情。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)提示炎性趨化因子的潛在作用，例如，CXCL9可能由MDSCs驅(qū)動在介導T790MTKI耐藥中發(fā)揮作用。此外，我們的數(shù)據(jù)突出了GEP“熱”腫瘤中TME成分的顯著異質(zhì)性，說明需要更詳細地詢問免疫環(huán)境以描繪特定的免疫靶點。

雖然第三代EGFRTKIs越來越多地被采用在一線環(huán)境中，但這種臨床實踐在一定程度上是由于無法預測單個患者的耐藥軌跡。在確定了與不同EGFRTKI抵抗狀態(tài)相關(guān)的新的分子特征(3Q擴增、轉(zhuǎn)錄亞型、腺癌譜系標記丟失和炎癥的TME)后，我們試圖建立一個模型來預測T790M的出現(xiàn)。我們推測，這些基因組、染色體水平和轉(zhuǎn)錄特征可能存在于基線水平，也可能代表在治療過程中獲得的變化(圖4A)。為了進一步探討這一點，我們確定了在1G/2GTKI治療開始之前可能存在的三個軀干特征：EGFR外顯子19缺失、WGD缺失和TP53改變(圖4A)。使用貝葉斯方法，單個患者可以根據(jù)他們治療前的分子基因型被分成不同的組，其發(fā)生EGFRT790M耐藥的幾率非常不同(圖4B)。例如，在非WGD腫瘤中，發(fā)生T790M耐藥性的概率在87.2到97.9之間，這可能意味著序貫治療第一代/第二代到第三代EGFRTKI可能是這些患者(我們隊列中11的患者)可行的臨床策略。這些特征的預測能力需要在更大的隊列中進一步驗證。然而，這些結(jié)果說明了數(shù)據(jù)驅(qū)動的治療算法是如何通過真實世界的證據(jù)得出的，并可能有助于為個別患者定義最佳的排序策略。

我們的研究首次對EGFRTKI耐藥的基因組和轉(zhuǎn)錄圖譜進行了全面和綜合的分析。值得注意的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，到目前為止，血統(tǒng)的可塑性在一定程度上被低估了。盡管在TKI耐藥后有1到3的患者有組織轉(zhuǎn)化的報道，但我們發(fā)現(xiàn)在T790M腫瘤中，腺癌標志物(napsinA和tTF1)普遍丟失，同時非t乳亞型(PI和PP)明顯富集。雖然缺乏配對的基線樣本是我們研究的局限性，但與治療單純的EGFR突變的非小細胞肺癌的比較表明，腺癌譜系標志的丟失，特別是在T790M疾病中，可能代表了慢性EGFRTKI暴露導致的早期去分化事件。T790M疾病更顯著的基因組改變有TP53突變(86比50)、3Q擴增(57比13)和MET改變(19比3)，這進一步導致了T790M的可塑性和耐藥性。

臨床上特別感興趣的是T790M隊列中的免疫熱亞群，它代表了一組患者的TTP明顯較短，其特征是GEP評分高，PDL1過度表達，以及富含趨化因子的免疫抑制微環(huán)境。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，回顧性分析表明PDL1的高表達與低應答率和PFS之間的關(guān)系，提示“炎癥性”TME介導對EGFRTKI的原發(fā)性耐藥。最近，抑制EGFR信號被發(fā)現(xiàn)可以耗竭Treg和增加IFNγ信號，支持“炎性”的TME之間的聯(lián)系，認為這是一種適應性變化，可能會削弱對靶向治療的反應。我們的數(shù)據(jù)進一步表明，炎性的TME可能發(fā)生在原發(fā)或繼發(fā)耐藥時，并由CD8T細胞(腫瘤抗原特異性和/或旁觀者)、Treg和MDSC可變地組成。最后，觀察到IDO1的高表達，特別是在T790M免疫熱腫瘤中，伴隨犬尿氨酸的過度表達(KYNU；圖2B)，暗示IDO途徑在維持Treg激活和在腫瘤亞群中的免疫抑制環(huán)境中起作用。最近，通過對一系列癌基因驅(qū)動的非小細胞肺癌腫瘤的單細胞RNASEQ，Maynard和他的同事同樣強調(diào)了IDO途徑、免疫微環(huán)境和肺泡再生細胞特征在靶向治療中的重要性。我們的數(shù)據(jù)擴展了這些觀察，說明了治療誘導的適應性細胞

狀態(tài)可能會受到基因組改變的影響，并表明癌細胞、免疫細胞群和趨化因子中EGFR依賴性和譜系可塑性之間存在復雜的相互作用。為了更好地闡明這些免疫介質(zhì)的作用，前瞻性研究正在進行中。免疫檢查點抑制，包括聯(lián)合抗PD1和抗4治療，在TKI耐藥環(huán)境下的臨床試驗中顯示明顯缺乏療效。除了正在努力評估腺苷軸的免疫抑制靶點，如腺苷2A受體(A2AR)、CD39和CD73，未來臨床試驗的合理靶點可能包括IDO、MDSC耗竭策略，如貝伐單抗或選擇性抑制PI3Kγ。