最終診斷 776.安全第一

遠(yuǎn)隔效應(yīng)是指放射治療期間或之后放射野外腫瘤的消退，已在各種癌癥中報(bào)道，例如黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和乳腺癌。雖然其機(jī)制尚未完全闡明，但遠(yuǎn)隔效應(yīng)可能是由輻射誘導(dǎo)的全身免疫反應(yīng)增強(qiáng)介導(dǎo)的。然而，很少觀察到遠(yuǎn)隔效應(yīng)，可能是因?yàn)榘┘?xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，包括免疫檢查點(diǎn)通路的激活。在過去十年中，新開發(fā)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑徹底改變了癌癥治療。隨著可增強(qiáng)針對癌細(xì)胞的全身免疫反應(yīng)的ICI的出現(xiàn)，結(jié)合ICI和放療的新治療方案有望增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)。正在積極研究ICI和RT的協(xié)同效應(yīng)，并且在各種報(bào)告中都研究了這種組合增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的潛力。

肝細(xì)胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌類型，也是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。早期HCC患者接受切除、肝移植和消融等治療方式的總生存率>60，而接受化療栓塞或全身治療的晚期HCC患者預(yù)后不佳。為了改善這種不良結(jié)果，最近在HCC治療中加入并建議了新方案，包括考慮使用ICI。因此，各種ICIs，包括程序性細(xì)胞死亡1抑制劑、PD配體1抑制劑和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4抑制劑，在HCC患者中的可行性和安全性正在研究中。然而，報(bào)道的ICIs的客觀緩解率僅為1520，仍不令人滿意。此外，最近評估派姆單抗治療晚期HCC患者療效和安全性的KEYNOTE240試驗(yàn)未能顯示與安慰劑相比在總生存期和無進(jìn)展生存期的改善方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于其免疫原性引起的遠(yuǎn)隔現(xiàn)象，RT在用于提高ICI對晚期HCC的療效方面受到了相當(dāng)大的關(guān)注。

最近在一些臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中檢測了協(xié)同治療在控制原發(fā)性HCC中的功效。然而，這些先前的研究沒有使用轉(zhuǎn)移性HCC模型，而是使用原位模型，這只能觀察RT和ICI對原發(fā)腫瘤的聯(lián)合作用，而不是遠(yuǎn)隔效應(yīng)。因此，在本研究中，我們旨在使用雙側(cè)小鼠同源HCC模型研究輻射對遠(yuǎn)隔現(xiàn)象的作用和免疫學(xué)機(jī)制，以及抗PD1抗體對遠(yuǎn)隔效應(yīng)的影響。

使用Hepa16細(xì)胞建立同系雙側(cè)HCC小鼠模型。腫瘤生長曲線顯示，與未照射的腫瘤相比，使用總劑量16Gy分兩次照射而不是在單次使用8Gy更顯著地抑制照射腫瘤生長和未照射的腫瘤生長。對第31天收獲的腫瘤進(jìn)行拍照，與單次8Gy照射相比，分兩次總劑量16Gy照射顯著提高小鼠的存活率的浸潤。此外，總劑量16Gy分兩次照射還增加了受照射腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤。

為了了解局部照射如何縮小未照射的腫瘤，我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測了小鼠右后腿的腫瘤引流的腹股溝淋巴結(jié)中的DCs。數(shù)據(jù)顯示，總劑量16Gy分兩次照射顯著增加了TDLN中活化DCs比例，這由CD40和CD80的高表達(dá)所證明。TDLN中CD11cDC上的共抑制分子PDL1的表達(dá)也由總劑量16Gy分兩次照射誘導(dǎo)。此外，總劑量16Gy分兩次照射顯著增加了CD4IFNγ和CD8IFNγT細(xì)胞，激活了TDLN中的T細(xì)胞。Tregs在TDLN中的積累在總劑量16Gy分兩次照射組中也比單個(gè)8Gy照射組更明顯。

基于顯示輻射增加TDLNDC中PDL1表達(dá)的結(jié)果，我們確定了PD1/PDL1通路的阻斷是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)同源雙側(cè)HCC小鼠的遠(yuǎn)隔效應(yīng)模型?？筆D1抗體比同型IgG對照更能抑制雙側(cè)Hepa16腫瘤的生長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？倓┝?6Gy分兩次照射抑制了受輻照和未受輻照的遠(yuǎn)側(cè)腫瘤的生長。與單獨(dú)放療或抗PD1單藥治療相比，放療和抗PD1聯(lián)合治療進(jìn)一步抑制了受輻射和未受輻射腫瘤的生長。用抗PD1抗體和輻射聯(lián)合治療的小鼠腫瘤明顯小于用輻射或抗PD1單一療法治療的小鼠的腫瘤。單獨(dú)的抗PD1治療并沒有提高生存率，但與放療相結(jié)合，它顯著提高了生存率。

使用CD4和CD8特異性抗體的免疫組織化學(xué)顯示，與IgG對照相比，單獨(dú)的抗PD1抗體和放療更顯著地增加了CD4和CD8細(xì)胞在照射腫瘤中的浸潤，CD4細(xì)胞向未放療的對側(cè)腫瘤的浸潤。用抗PD1抗體和輻射聯(lián)合治療進(jìn)一步增強(qiáng)了CD8細(xì)胞向兩種腫瘤的浸潤，盡管沒有明顯的累加效應(yīng)。

對第31天收獲的腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析表明，在受照射的腫瘤中，總劑量16Gy分兩次照射，而不是抗PD1抗體治療更顯著增加CD4和CD4IFNγT細(xì)胞的浸潤。類似地，總劑量16Gy分兩次照射增加了總CD8和CD8IFNγT細(xì)胞的浸潤。與單獨(dú)使用抗PD1抗體而不是單獨(dú)使用輻射相比，用抗PD1抗體和輻射聯(lián)合治療進(jìn)一步增強(qiáng)了CD4和CD8T細(xì)胞的浸潤。放療和抗PD1抗體均增加了未受照射腫瘤中的CD4和CD4IFNγT細(xì)胞，但不增加CD8T細(xì)胞，而它們的聯(lián)合治療增加了總CD8和CD8IFNγT細(xì)胞超過任何一種單獨(dú)治療。與IgG對照治療相比，放射和抗PD1抗體的組合增加了兩側(cè)腫瘤中CD25CD4Foxp3Tregs的浸潤，而在各組之間沒有觀察到CD11cDCs的差異。

流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析顯示，CD220B細(xì)胞、F4/80巨噬細(xì)胞、Ly611b中性粒細(xì)胞、Ly611bLy6C單核骨髓源性抑制細(xì)胞和Ly611bLy6Clow粒細(xì)胞MDSCs的數(shù)量不受單一療法或聯(lián)合療法的影響，除了CD3T細(xì)胞。

遠(yuǎn)隔效應(yīng)是一種由輻射引起的罕見現(xiàn)象，可以通過免疫療法得到加強(qiáng)。盡管放射療法和免疫療法越來越多地用于治療肝細(xì)胞癌，但免疫療法是否可以增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)仍不清楚。在這項(xiàng)研究中，旨在闡明在鼠HCC模型中由輻射和免疫治療相結(jié)合引起的遠(yuǎn)隔效應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制。通過將小鼠Hepa16HCC細(xì)胞接種到具有免疫活性的C57BL/6小鼠的兩條后腿上，建立同源HCC小鼠模型。右后腿的腫瘤被照射，在左后腿未照射的腫瘤中觀察到遠(yuǎn)隔效應(yīng)，有或沒有抗程序性細(xì)胞死亡1抗體的共同給藥。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以分析浸潤受照射和未受照射的腫瘤以及腫瘤引流淋巴結(jié)的免疫細(xì)胞的分布。與單次8Gy照射相比，兩次共16Gy照射更有效地抑制了受輻射和未受輻射的腫瘤的生長，細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤浸潤更高。更高的劑量還增加了TDLN中活化的樹突細(xì)胞，其具有更高的程序性細(xì)胞死亡配體1的表達(dá)?？筆D1抗體的共同給藥顯著增強(qiáng)了遠(yuǎn)隔效應(yīng)，并增加了受照射和非照射的活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞的浸潤。受輻射的腫瘤。的研究結(jié)果表明，在放療中加入抗PD1療法可增強(qiáng)HCC同源小鼠模型的遠(yuǎn)隔效應(yīng)。

紅細(xì)胞的生成是一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的過程。在穩(wěn)態(tài)的血細(xì)胞生成過程中，骨髓每小時(shí)大約產(chǎn)生1010個(gè)紅細(xì)胞，以使血紅蛋白水平維持在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)。在持續(xù)失血或溶血的情況下，紅細(xì)胞的生成可快速增加。

骨髓的紅系祖細(xì)胞是定向分化的單系祖細(xì)胞，從有雙向或多向分化潛能的祖細(xì)胞隨機(jī)分化而來的。

有兩種紅系祖細(xì)胞不能通過特定的形態(tài)學(xué)特征予以識別，但能采用流式細(xì)胞技術(shù)予以純化和分析。有證據(jù)顯示所有造血祖細(xì)胞或干細(xì)胞與淋巴母細(xì)胞相似。

1、局部照射減少小鼠脾臟中腫瘤引起的Ter細(xì)胞聚集

前期發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)紅細(xì)胞祖細(xì)胞的產(chǎn)生與不良預(yù)后顯著相關(guān)，而靶向EPC或其產(chǎn)物可抑制腫瘤的進(jìn)展。

LCC荷瘤小鼠脾腫大，放療后基本恢復(fù)正常大小。Ter119CD71EPCs放療后，其比例也明顯恢復(fù)到基線水平。此外，在MC38、B16SIY荷瘤模型中，也觀察到了放療后Ter細(xì)胞顯著減少的現(xiàn)象，表明放療誘導(dǎo)的Ter細(xì)胞減少并不局限于某種腫瘤類型。

2、IFNs與T細(xì)胞是輻射影響Ter細(xì)胞所必須的

文獻(xiàn)報(bào)道放療可通過I型干擾素和T細(xì)胞觸發(fā)局部和全身抗腫瘤免疫，為了確定I型IFN在放療介導(dǎo)Ter細(xì)胞減少中的作用。采用IFNARKO小鼠，發(fā)現(xiàn)放療可使WT小鼠脾臟減小、脾細(xì)胞數(shù)量減少、Ter細(xì)胞數(shù)量減少，但I(xiàn)FNARKO小鼠中該現(xiàn)象消失。還對比了局部照射或外源性注射干擾素治療WT小鼠腫瘤的效果，發(fā)現(xiàn)兩者均可減少Ter細(xì)胞數(shù)量。這表明I型干擾素信號途徑對于放療介導(dǎo)的Ter細(xì)胞減少是必需的。

鑒于T細(xì)胞在放療抗腫瘤中具有一定作用，研究人員探索了T細(xì)胞在放療介導(dǎo)Ter細(xì)胞減少中的作用。采用免疫缺陷小鼠模型RAGKO，發(fā)現(xiàn)RAGKO小鼠放療后Ter細(xì)胞并未減少，表明放療誘導(dǎo)Ter細(xì)胞減少依賴于T細(xì)胞。

為探索是CD4或CD8亞群T細(xì)胞在其中發(fā)揮作用，采用抗體清除CD4或CD8T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)清除CD8T細(xì)胞后，放療誘導(dǎo)的Ter細(xì)胞減少作用消失，表明是CD8而非CD4T細(xì)胞發(fā)揮作用。

3、通過阻斷PDL1可減少腫瘤誘導(dǎo)的依賴于CD8T細(xì)胞和IFNγ的Ter細(xì)胞聚集

PDL1抑制劑能夠增強(qiáng)CD8T細(xì)胞的功能。PDL1抑制劑能否逆轉(zhuǎn)脾臟Ter細(xì)胞積累？對荷瘤小鼠腹腔注射PDL1抗體或進(jìn)行放療，發(fā)現(xiàn)PDL1抗體或放療均抑制脾腫大和減少脾細(xì)胞，降低脾臟Ter細(xì)胞的比例和數(shù)量。

PDL1抗體還減少脾臟中ARTN的表達(dá)，降低血清中ARTN的濃度。因此，PDL1抗體可降低腫瘤誘導(dǎo)的Ter細(xì)胞積累和ARTN的產(chǎn)生，且其作用依賴于CD8T細(xì)胞和IFN。

4、Ter細(xì)胞和ARTN破壞放療或IO的療效

體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與Ter細(xì)胞共培養(yǎng)，或腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中外源加入ARTN，均可增強(qiáng)小鼠腫瘤細(xì)胞的抗輻射能力。而Ter細(xì)胞和ARTN會(huì)使CD8T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用減弱。

在體內(nèi)模型中，通過過繼性轉(zhuǎn)移Ter細(xì)胞或外源性注射ARTN減弱放療和PDL1抗體抗腫瘤作用。表明免疫治療和放療的治療作用部分依賴于它們對Ter細(xì)胞的抑制。

5、破壞Ter細(xì)胞ARTN軸可以促進(jìn)放療或IO的療效

破壞Ter/ARTN軸能夠提高放療和PDL1抗體的療效。antiTer119抗體耗竭小鼠Ter細(xì)胞后放療和PDL1抗體的作用提高，阻斷ARTN也能增強(qiáng)療效。

6、放療和IO應(yīng)答患者顯示出治療導(dǎo)致的Ter細(xì)胞減少

發(fā)現(xiàn)在接受放化療的NSCLC患者中，治療后沒有復(fù)發(fā)的患者治療后血液中ARTN濃度顯著降低，但治療后復(fù)發(fā)患者的血液中ARTN濃度無顯著變化。

一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)患者接受放療后進(jìn)行免疫治療，放療后完全或部分緩解患者的Ter細(xì)胞豐度顯著下降，腫瘤進(jìn)展的患者中，Ter細(xì)胞豐度無顯著變化。表明患者對于放療和免疫治療的響應(yīng)與其Ter細(xì)胞數(shù)量以及ARTN濃度相關(guān)。

研究小結(jié)

放療和PDL1阻斷治療能夠降低腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ter細(xì)胞和ARTN水平，機(jī)制層面，放療和PDL1阻斷治療可使體內(nèi)發(fā)生由干擾素、DCs和CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，這些應(yīng)答也是治療充分發(fā)揮療效所必需的，同時(shí)，阻斷Ter細(xì)胞ARTN軸可以促進(jìn)放療和抗PDL1治療的效果。