最終診斷 781.裂

后天或者元旦完結(jié)

有很多研究發(fā)發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律相關(guān)因子的失調(diào)與NSCLC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此識(shí)別出晝夜節(jié)律相關(guān)因子也是目前臨床所需要的。該研究發(fā)現(xiàn)，HLF在早期復(fù)發(fā)的NSCLC組織中顯著降低，與NSCLC患者的早期進(jìn)展與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。并且上調(diào)HLF可抑制肺定植，而沉默HLF可促進(jìn)體內(nèi)NSCLC細(xì)胞向骨、肝和腦的轉(zhuǎn)移。

機(jī)制：下調(diào)HLF促進(jìn)非錨定的NSCLC細(xì)胞在低營養(yǎng)條件下的無氧代謝，通過PPARα和PPARγ轉(zhuǎn)運(yùn)、激活NFκB/p65信號(hào)通路，基因的缺失和甲基化均有助于下調(diào)NSCLC組織中的HLF的表達(dá)。HLF有可能成為臨床干預(yù)NSCLC的新靶點(diǎn)。

雖然多種治療策略對原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的治療具有良好的前景，但由于其早期復(fù)發(fā)和廣泛的轉(zhuǎn)移潛力，非小細(xì)胞肺癌仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。

從名字上說，晝夜節(jié)律相關(guān)分子由一系列的時(shí)鐘基因和蛋白質(zhì)組成，在睡眠周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究報(bào)道，晝夜節(jié)律相關(guān)調(diào)節(jié)因子的失調(diào)通過不同的機(jī)制與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年來，生物鐘基因在NSCLC中的作用得到了廣泛的關(guān)注。例如，在肺腺癌中，過表達(dá)CRY2、BMAL1和RORA聯(lián)合下調(diào)TIMELESS和NPAS2的表達(dá)與預(yù)后良好相關(guān)，而DEC1和TIMELESS高表達(dá)預(yù)示著在鱗狀細(xì)胞NSCLC中較差的總生存率。

通過分析來自癌癥基因組圖譜的NSCLC數(shù)據(jù)集中的多個(gè)晝夜相關(guān)調(diào)控因子和我們之前來自Array表達(dá)的整合RNA表達(dá)譜，在目前的研究中，我們辨認(rèn)出了一個(gè)晝夜基因——肝白血病因子，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在早期復(fù)發(fā)的NSCLC組織中顯著減少，這與NSCLC患者的早期進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

來自TCGA的NSCLCRNA測序數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)與相鄰正常組織相比，NSCLC組織中HLF的表達(dá)水平顯著降低。通過分析來自TCGA的NSCLC數(shù)據(jù)集，與非復(fù)發(fā)的NSCLC組織3年內(nèi)未復(fù)發(fā)，n72）相比，HLF也是早期復(fù)發(fā)的NSCLC組織中所有晝夜節(jié)律相關(guān)調(diào)節(jié)下調(diào)因子之一。

我們之前基于AffymetrixU133Plus2.0芯片結(jié)合TCGA分析的NSCLC整合數(shù)據(jù)譜的結(jié)果進(jìn)一步表明，NSCLC組織中HLF的表達(dá)顯著下調(diào)，并且在早期復(fù)發(fā)的NSCLC組織中進(jìn)一步減少。

圖片RealtimePCR和Western印跡分析顯示，與匹配的ANT相比，7/10對NSCLC組織中HLF的mRNA和蛋白水平降低與3年非復(fù)發(fā)NSCLC組織的HLFmRNA表達(dá)和蛋白水平。轉(zhuǎn)錄水平歸一化為GAPDH表達(dá)，P<0.05。

此外，與非復(fù)發(fā)NSCLC組織相比，早期復(fù)發(fā)NSCLC組織中HLF表達(dá)顯著下調(diào)。

不同亞型NSCLC及良性肺疾病組織中HLF免疫組化染色的典型圖片。惡性NSCLC組織和良性肺組織中HLF不同免疫組化染色指數(shù)的病例數(shù)。與TCGA相比，ADC和SQC中HLF表達(dá)下調(diào)。來自TCGA和AEmeta的NSCLC數(shù)據(jù)集證明了這一點(diǎn)

KaplanMeier生存分析進(jìn)一步顯示，與高HLF表達(dá)的NSCLC患者相比，低HLF表達(dá)的NSCLC患者的無進(jìn)展生存期更差，這與TCGA、AEmeta和KMPlotter分析結(jié)果一致。

同樣，在低HLF表達(dá)的ADC和SQC患者中觀察到較短的無進(jìn)展生存期。

以上結(jié)果說明，低表達(dá)HLF與NSCLC的晚期臨床病理特征和早期進(jìn)展相關(guān)。

此外，HLF的表達(dá)水平隨著臨床分級和階段的提高而逐漸下降，TCGA，AEMeta和KMPlotter，在相同臨床階段的NSCLC患者中也有類似的發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，低表達(dá)HLF與NSCLC患者的早期進(jìn)展和晚期臨床病理特征顯著正相關(guān)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中，HLF下調(diào)與較短的局部無復(fù)發(fā)生存期和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存期呈正相關(guān)。同樣，低表達(dá)HLF的ADC患者以及SQC患者的局部無復(fù)發(fā)生存期和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存期較差。以上結(jié)果說明，低表達(dá)HLF促進(jìn)NSCLC早期局部復(fù)發(fā)和多器官遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

為了進(jìn)一步確定HLF在NSCLC細(xì)胞局部肺定植和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用，首先在多個(gè)不同亞型的NSCLC細(xì)胞株中檢測了HLF的表達(dá)。

如補(bǔ)充圖4A和B所示，與非癌永生化肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS2B和正常肺成纖維細(xì)胞WI38相比，NSCLC細(xì)胞中HLF的mRNA和蛋白質(zhì)水平差異下調(diào)。我們進(jìn)一步構(gòu)建了HLF過表達(dá)的NCIH1975和NCIH520肺癌細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)所有NSCLC細(xì)胞系中HLF水平最低，并內(nèi)源性下調(diào)NCIH460和NCIH1299細(xì)胞HLF的表達(dá)，這兩種細(xì)胞均表達(dá)最高的內(nèi)源性HLF水平。

值得注意的是，HLF表達(dá)的改變不僅影響大肺結(jié)節(jié)的形成，但也影響小肺結(jié)節(jié)的形成，這支持了HLF在腫瘤細(xì)胞的早期定植和隨后的肺內(nèi)生長中都起著重要作用的觀點(diǎn)。

最后，與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)相比，在注射HLF穩(wěn)定過表達(dá)的H1975細(xì)胞和下調(diào)H460細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中，進(jìn)一步證實(shí)了相應(yīng)的高和低表達(dá)水平。

然后，采用體內(nèi)左心室接種小鼠模型檢測HLF對NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響，將載體/NCIH1975、HLF過表達(dá)NCIH1975、載體/NCIH460和HLFsh#1/NCIH460細(xì)胞接種到小鼠左心室。

接種細(xì)胞6周后，收集小鼠的脛骨、腦、肝組織，并進(jìn)行H&E染色處理。如圖所示。圖3FI和補(bǔ)充圖4G，我們在與載體組相比，過HLF表達(dá)小鼠組中，包括骨、大腦和肝臟等遠(yuǎn)處器官檢測到較少的轉(zhuǎn)移性腫瘤，以及較長的累積存活期延長。

相比之下，沉默HLF可顯著增強(qiáng)骨、腦和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成，并縮短生存期。

因此，這些結(jié)果表明，低表達(dá)HLF的NSCLC細(xì)胞具有更強(qiáng)的局部定植和生長能力，以及更強(qiáng)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。

我們利用CCK8、集落形成和An連接素凋亡進(jìn)一步研究了HLF在NSCLC中的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下，HLF對NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡能力沒有顯著影響。

我們的結(jié)果顯示，上調(diào)HLF會(huì)增加培養(yǎng)液的PH水平，而沉默HLF會(huì)降低培養(yǎng)基的pH水平，但正常情況下HLF并不影響NSCLC細(xì)胞的表型和數(shù)量。

低表達(dá)HLF可能通過營養(yǎng)代謝途徑促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對低營養(yǎng)狀態(tài)的適應(yīng)，因?yàn)榧词乖谡５暮鯒l件下，癌細(xì)胞也更傾向于通過厭氧途徑代謝。

然而，上調(diào)HLF抑制NSCLC的生長，而沉默HLF可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的錨定和懸浮生長能力，表明沉默HLF增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞在懸浮條件下的生存能力，即anoikis耐藥。這是各種癌癥中與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的主要特征。

事實(shí)上，晝夜節(jié)律基因的失調(diào)導(dǎo)致了NSCLC的代謝失調(diào)，HLF廣泛參與了多種物質(zhì)代謝過程，包括脂質(zhì)和氧化代謝。

在低血清和低葡萄糖培養(yǎng)液組成的低營養(yǎng)條件下，HLF過表達(dá)抑制了

NSCLC細(xì)胞的增殖，但增加了凋亡潛能，反之亦然。

HLF參與了癌細(xì)胞生長培養(yǎng)基的營養(yǎng)代謝，這是HLF抑制NSCLC細(xì)胞生長的前提條件。

在低營養(yǎng)條件下觀察NSCLC細(xì)胞HLF對葡萄糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)的影響。如補(bǔ)充圖6A，HLF表達(dá)的改變并不影響總蛋白含量。然而，HLF的上調(diào)降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了游離脂肪酸的水平。

矛盾的是，上調(diào)HLF增加了細(xì)胞內(nèi)ATP的總產(chǎn)生和LDH的活性的活性，厭氧糖酵解限速酶，一些厭氧糖酵解和乳酸發(fā)酵相關(guān)基因，但增強(qiáng)了多個(gè)三羧酸循環(huán)相關(guān)基因。上訴結(jié)果表明，低表達(dá)HLF促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的厭氧代謝。

事實(shí)上，即使在氧含量正常的情況下，癌細(xì)胞也表現(xiàn)出葡萄糖代謝特征的改變，更傾向于無氧代謝，這一現(xiàn)象被稱為“瓦伯格效應(yīng)”。綜上所述，我們的結(jié)果表明，低表達(dá)HLF可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞從三羧酸循環(huán)向厭氧代謝的首選代謝途徑的轉(zhuǎn)換，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞在低營養(yǎng)條件下的生長。

為了進(jìn)一步確定低營養(yǎng)條件下HLF抑制NSCLC生長和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，我們將多個(gè)信號(hào)通路的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。如圖5A所示，上調(diào)HLF顯著增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞PPAR信號(hào)活性，抑制了NFκB信號(hào)活性;相反，沉默HLF則產(chǎn)生相反的效果。

基于TCGA的NSCLC數(shù)據(jù)集中HLF的表達(dá)進(jìn)行了基因集富集分析，結(jié)果顯示HLF的表達(dá)水平與PPAR信號(hào)呈正相關(guān)，而與NFκB信號(hào)呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)GSEA分析，HLF表達(dá)與脂質(zhì)氧化和糖酵解顯著相關(guān)。

重要的是，一些證據(jù)表明，HLF通過增加脂解誘導(dǎo)的游離脂肪酸積累，參與PPAR的易位和激活，通過破壞p65與靶DNA的結(jié)合，NFκB信號(hào)通路廣泛參與了癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。PPAR信號(hào)通路由PPARα、PPARβ/δ和PPARγ等幾個(gè)家族成員組成。因此，確定參與HLF抑制NFκB信號(hào)通路以及NSCLC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的特異性PPAR成員至關(guān)重要。

首先，檢測10對NSCLC組織中PPARα、PPARβ/δ和PPARγ的表達(dá)水平。如補(bǔ)充圖6G和H，PPARα在4/10對組織中表達(dá)顯著下調(diào)，PPARγ在8/10對表達(dá)，而PPARβ/δ在8/10對組織中表達(dá)上調(diào)。已有廣泛報(bào)道稱PPARα和PPARγ在NSCLC中起腫瘤抑制信號(hào)的作用，而據(jù)報(bào)道PPARβ/δ對起致癌作用。

Westernblot分析一致顯示，HLF的上調(diào)增加了PPARα和PPARγ的總表達(dá)和核易位，增加了IκBα的表達(dá)，但降低了磷酸化的NFκB和p65的總水平和核水平。相反，沉默HLF則發(fā)揮了相反的作用。因此，我們的研究結(jié)果表明，HLF在NSCLC中激活PPARα和PPARγ，抑制NFκB/p65信號(hào)通路。

我們使用PPARα激動(dòng)劑非諾貝特、PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮和NFκB信號(hào)抑制劑LY2409881，進(jìn)一步研究了PPARα/PPARγ/NFκB/p65信號(hào)軸在HLF在NSCLC細(xì)胞中的功能作用中的意義。

我們的結(jié)果顯示，在HLF沉默的細(xì)胞中，非諾貝特和吡格列酮顯著上調(diào)了PPAR的活性，而LY2409881則沒有上。

然而，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881差異降低了HLF沉默細(xì)胞中NFκB信號(hào)的活性。

重要的是，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881減弱了HLF下調(diào)對細(xì)胞非錨定生長和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881逆轉(zhuǎn)了低營養(yǎng)條件下HLF下調(diào)對NSCLC細(xì)胞的促增殖和抗凋亡作用