最終診斷 765.隱蔽、狡猾、善變

最近在忙新書(shū)，還有本職工作，所以修改會(huì)慢一點(diǎn)，大家可以等完本再看

放療(RT)是肺癌必不可少的治療方式。對(duì)于不適合手術(shù)的IIIA和IIIB期肺癌患者，根治性放化療是治療標(biāo)準(zhǔn)，這一點(diǎn)已被廣泛接受。不幸的是，放療后腫瘤的再生長(zhǎng)是成功控制疾病的主要障礙。

臨床前研究表明，放療對(duì)原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的腫瘤免疫微環(huán)境具有雙重作用。一方面，局部照射有可能激活針對(duì)遠(yuǎn)離照射區(qū)域的腫瘤細(xì)胞的全身免疫反應(yīng)，即遠(yuǎn)隔效應(yīng)，由Mole在1953年首次報(bào)道。RT促進(jìn)腫瘤抗原從垂死的腫瘤細(xì)胞中釋放，上調(diào)MHCI類表達(dá)，并增加多種細(xì)胞因子和免疫效應(yīng)分子的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素(IL)1、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM1)和血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM1)，所有這些都有助于由輻射引發(fā)的持久和全身抗腫瘤免疫。另一方面，放療促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。例如，RT上調(diào)多種免疫抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子α(TNFα)、IL6、IL10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)。RT促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的積累，例如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)、調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)。輻射增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)的活性，如程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD1)/PDL1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4()、T細(xì)胞免疫球蛋白和含粘蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白3(TIM3)，和淋巴細(xì)胞激活基因3(LAG3)。

為了克服放療的免疫抑制作用，已經(jīng)提出并測(cè)試了免疫療法和放療的各種組合。在PACIFIC研究中，標(biāo)準(zhǔn)放化療后加入durvalumab可延長(zhǎng)III期NSCLC患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。PACIFIC研究的巨大成功不僅改變了III期非小細(xì)胞肺癌的臨床指南，也引起了其他免疫療法與RT結(jié)合的極大興趣。

MDSCs的積累和激活在免疫抑制的建立中起關(guān)鍵作用。RT對(duì)MDSCs的確切影響是復(fù)雜的。大分割照射(20Gy)抑制MDSCs的積累和浸潤(rùn)，而較低劑量的照射往往會(huì)促進(jìn)MDSCs募集到腫瘤中。此外，臨床前和臨床研究表明，胃腸道腫瘤，包括結(jié)直腸癌和肝癌，在放療后相對(duì)容易出現(xiàn)MDSCs水平降低，而在其他腫瘤模型和臨床環(huán)境中，如膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、前列腺癌和宮頸癌，導(dǎo)致MDSC數(shù)量持續(xù)增加。蔡等人首次報(bào)道MDSCs的PDL1表達(dá)被輻照上調(diào)。然而，關(guān)于MDSCs的確切作用，尤其是其潛在機(jī)制，在輻照后塑造TME方面知之甚少。

MDSCs是一組具有強(qiáng)大免疫抑制能力的異質(zhì)髓細(xì)胞。根據(jù)表型和形態(tài)，MDSCs又可分為多形核MDSCs(PMNMDSCs，又稱粒細(xì)胞型MDSCs)和單核型MDSCs(MMDSCs)。

免疫抑制活性是MDSCs的關(guān)鍵標(biāo)志。MDSCs的抑制機(jī)制包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(ARG1)和吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)的表達(dá)，以及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的產(chǎn)生。這些不同的機(jī)制不會(huì)同時(shí)起作用。人們普遍認(rèn)為PMNMDSCs和MMDSCs通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控TME。此外，PDL1的上調(diào)也被認(rèn)為是輻射招募MDSCs的免疫抑制機(jī)制之一。目前，對(duì)于輻照誘導(dǎo)的MDSCs對(duì)TME的影響及放療的治療效果尚無(wú)一致的結(jié)論。

磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑，如西地那非和他達(dá)拉非，可以阻斷環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)的水解。最新數(shù)據(jù)表明，PDE5抑制劑能夠通過(guò)抑制荷瘤(TB)小鼠和患者M(jìn)DSC中iNOS和ARG1的活性和表達(dá)來(lái)促進(jìn)抗腫瘤免疫。然而，PDE5抑制劑如何影響MDSC的亞群以及RT和PDE5抑制劑的組合是否會(huì)延遲輻射后的腫瘤再生尚未得到測(cè)試。

我們最近的研究表明，消除招募的MDSC會(huì)延遲放療后路易斯肺癌(LLC)的再生。在這里，我們報(bào)告了局部照射通過(guò)促進(jìn)PMNMDSC的增殖及其隨后向TME的募集而削弱了抗腫瘤免疫力。ARG1的上調(diào)和激活是照射后PMNMDSCs介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制的主要機(jī)制。西地那非與放療的組合通過(guò)抑制ARG1過(guò)表達(dá)和PMNMDSC募集消除了輻射衍生的免疫抑制。

在TB小鼠和癌癥患者中，MDSCs隨著腫瘤的生長(zhǎng)而擴(kuò)增。MDSCs的兩個(gè)亞群之間的比例取決于特定的腫瘤模型和微環(huán)境。為了監(jiān)測(cè)同源LLC模型中MDSC的豐度，我們通過(guò)免疫表型分析確定了接種后腫瘤的生長(zhǎng)以及LLC小鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的總體MDSC及其亞群。

如圖1C所示，腫瘤組織中總MDSCs的百分比隨著腫瘤的發(fā)展而穩(wěn)步增加，從接種后第一周腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的不到10（5.84±1.22）上升到第四周超過(guò)20（21.71±3.22）（P<0.01）。在我們的LLC模型中，PMNMDSCs占總MDSCs的94.94±8.47，并且與總MDSCs具有相同的腫瘤發(fā)展趨勢(shì)（P<0.05）。對(duì)亞群進(jìn)行分析，雖然MMDSCs增加了大約5倍，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了更好地了解MDSCs的全身分布，我們還研究了MDSCs在外周血、脾臟和骨髓中的比例。僅在接種LLC細(xì)胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是無(wú)瘤小鼠的兩倍(27.33±4.62vs.12.48±0.93，P<0.05)，3周后的MDSC百分比是無(wú)瘤小鼠的5倍(27.33±4.62vs.12.48±0.93，P<0.05)。TB小鼠外周血中PMNMDSCs的比例也增加，而MMDSCs的比例與腫瘤大小無(wú)關(guān)。

PDL1是腫瘤細(xì)胞、MDSCs、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的最重要的檢查點(diǎn)分子之一。為了確定TB小鼠MDSCs的PDL1表達(dá)是否與健康小鼠不同，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試了MDSCs的PDL1表達(dá)。結(jié)果表明，TME中MDSCs上PDL1的平均熒光強(qiáng)度（MFI）從在LLC細(xì)胞接種后的第一周386.8±100.9逐漸增加到第四周的1，068.0±121.8（P<0.01），這表明PDL1在我們模型中的MDSC中具有潛在作用。

在脾臟和骨髓中，隨著腫瘤的發(fā)展，MDSCs的比例也顯著增加，其模式與腫瘤組織和外周血中的MDSCs相同。此外，我們?cè)赥B小鼠中觀察到明顯的脾腫大，這與我們觀察到的MDSCs在脾內(nèi)聚集一致。

為了確定局部照射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和MDSCs的影響，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到7.5mm時(shí)，我們使用大分割RT(20Gy/F)治療皮下LLC腫瘤。放療導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展延遲長(zhǎng)達(dá)一周，在第7至第10天的最小體積約為500mm3，但此后腫瘤開(kāi)始再生。根據(jù)放療前后腫瘤生長(zhǎng)曲線，我們選擇放療后第3天為再生前生長(zhǎng)，放療后1周為腫瘤體積最小時(shí)為再生開(kāi)始，放療后2周和3周為再生階段。腫瘤組織蘇木精伊紅染色顯示，與未治療的腫瘤相比，放療后的腫瘤中有更多的浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞。隨后的CD11b特異性免疫組化染色顯示，大多數(shù)炎癥細(xì)胞是CD11b髓系細(xì)胞，這表明局部照射可能導(dǎo)致MDSCs的積累。為了證實(shí)我們的假設(shè)，我們?cè)诰植空丈浜蟮牟煌瑫r(shí)間點(diǎn)對(duì)總MDSCs和這兩個(gè)亞群進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。局部照射后，放療后腫瘤浸潤(rùn)MDSCs的比例比未治療腫瘤高2倍(ctrlvs.RT21.33±3.29vs.44.10±3.00，P<0.001)。PMNMDSCs與總MDSCs具有相同的增加趨勢(shì)(ctrlvs.RT16.37±2.47vs.38.66±4.24，P<0.001)，而MMDSC比例保持在約0.1，且與腫瘤大小和治療無(wú)關(guān)。外周血情況同腫瘤組織。

為了確定受照射腫瘤中PMNMDSC的逐漸積累是否有助于LLC腫瘤的再生長(zhǎng)，或者這種積累是否僅僅是腫瘤生長(zhǎng)的結(jié)果，使用抗Ly6G單克隆抗體來(lái)消耗MDSC.抗Ly6G抗體的應(yīng)用顯著降低了腫瘤部位和外周血中PMNMDSC的頻率（P<0.05）。此外，用抗Ly6G抗體治療大大延遲了照射后的再生，這表明PMNMDSC的募集對(duì)腫瘤再生至關(guān)重要。

雖然PMNMDSCs利用一系列機(jī)制來(lái)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，這涉及到許多免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，但對(duì)CD8T細(xì)胞的抑制無(wú)疑是最重要的。為了確定RT后PMNMDSCs誘導(dǎo)的免疫抑制是否依賴于CD8T細(xì)胞，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了CD8T細(xì)胞的數(shù)量和功能。

如圖3D所示，CD8T細(xì)胞的百分比隨著照射從11.71±2.31下降到2.42±0.62(P<0.01)。PMNMDSC耗竭逆轉(zhuǎn)了這種下降（RTantiLy6G抗體2.42±0.62vs.20.12±3.92，P<0.01）。為了更好地了解CD8T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤部位的功能狀態(tài)，我們測(cè)量了CD8T細(xì)胞內(nèi)部和表面上IFNγ、CD28和PD1的表達(dá)。局部RT顯著降低了CD8T細(xì)胞分泌IFNγ的比例，從33.064.53降至13.252.08，并增加了表達(dá)PD1的CD8T細(xì)胞的比例（ctrlvs.RT253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，P<0.05）。

CD28表達(dá)未觀察到顯著變化。當(dāng)抗Ly6G抗體被給予輻照小鼠時(shí)，IFNγ分泌達(dá)到與未處理的LLC小鼠相同的水平（29.74±3.55），而與輻照小鼠進(jìn)行比較抗Ly6G抗體處理后的PD1表達(dá)沒(méi)有變化小鼠。因此，在這部分我們建議PMNMDSCs通過(guò)抑制CD8T細(xì)胞促進(jìn)放療后腫瘤的再生。PMNMDSCs不僅抑制了TME中CD8T細(xì)胞的數(shù)量，而且還抑制了其活性。

為了確定輻照誘導(dǎo)MDSCs的抑制機(jī)制，我們進(jìn)行了免疫組化染色及iNOS和ARG1活性檢測(cè)。腫瘤切片的免疫組化染色顯示，局部RT增強(qiáng)了ARG1的表達(dá)，但沒(méi)有增強(qiáng)iNOS的表達(dá)。ARG1活性測(cè)定表明，局部照射顯著提高了ARG1的活性，從0.400.15U/L提高到3.780.39U/L((P<0.01)。相比之下，NO熒光標(biāo)記的iNOS活性檢測(cè)顯示，輻照和未處理的腫瘤組織樣本的熒光強(qiáng)度相似。

PDL1的表達(dá)是MDSCs的一種新型免疫抑制機(jī)制。然后我們?cè)儐?wèn)PDL1上調(diào)是否是RT后MDSCs介導(dǎo)的免疫抑制的機(jī)制之一。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析輻照后MDSC中PDL1的表達(dá)。圖4E顯示，與未處理組相比，受照射腫瘤的MDSC中的PDL1表達(dá)在照射后不久顯著增加（照射后第三天：ctrlvs.RT443.9±175.3auvs.1328.0±324.3au，P<0.05）.然而，此后PDL1表達(dá)繼續(xù)下降，局部照射組在照射后第3周顯著低于未治療組（ctrlvs.RT1，465.0±399.6auvs.407.5±164.8au，P<0.05）。外周血中MDSCs的PDL1表達(dá)與局部腫瘤部位的表達(dá)趨勢(shì)相同。

以上數(shù)據(jù)表明ARG1表達(dá)的上調(diào)是照射后PMNMDSCs抑制功能的合理機(jī)制。然而，不涉及PDL1和iNOS的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一假設(shè)，在輻射后通過(guò)灌胃給予ARG1抑制劑norNOHA。10mg/kg/dnorNOHA有效地將ARG1活性從3.780.39U/L降低到2.020.25U/L（P<0.01）。

RT后給予norNOHA顯著增加CD8T細(xì)胞比例（RTvs.RTnorNOHA2.420.62vs.6.140.64，P<0.01），并伴有腫瘤再生延遲。iNOS抑制劑1400W對(duì)腫瘤再生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

我們的結(jié)果表明，RT通過(guò)上調(diào)腫瘤內(nèi)PMNMDSC的百分比和ARG1活性來(lái)促進(jìn)腫瘤免疫逃避。推測(cè)抑制PMNMDSCs及其ARG1活性可能是一種新的抗腫瘤策略是合理的。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PDE5抑制劑可以抑制TB小鼠和癌癥患者M(jìn)DSC中iNOS和ARG1的活性和表達(dá)。因此，通過(guò)灌胃給予西地那非20mg/kg/d，以研究它是否可以促進(jìn)RT的抗腫瘤作用并闡明潛在機(jī)制。如圖5B所示，正如我們預(yù)期的那樣，西地那非延遲了照射后的腫瘤再生長(zhǎng)，這與陽(yáng)性對(duì)照NorNOHA相當(dāng)。TME的免疫特征表明，當(dāng)給予西地那非時(shí)，腫瘤內(nèi)PMNMDSC的比例從38.66±4.24下降到23.57±2.38。

此外，西地那非也顯著降低了ARG1的表達(dá)。為了進(jìn)一步檢查西地那非對(duì)MDSC的抑制是否真的導(dǎo)致抗腫瘤免疫增強(qiáng)，我們分析了腫瘤內(nèi)CD8T細(xì)胞的比例和活性。流式細(xì)胞術(shù)分析表明CD8T細(xì)胞的百分比從2.42±0.62增加到7.21±1.22。

此外，當(dāng)給予西地那非時(shí)，CD8T細(xì)胞分泌的IFNγ也顯著升高。因此，我們證實(shí)PDE5抑制劑西地那非通過(guò)調(diào)節(jié)PMNMDSCs改善了照射后腫瘤免疫微環(huán)境。西地那非聯(lián)合放療可能是提高放療療效的一種有前景的策略。

工作揭示了PMNMDSCs中ARG1通路介導(dǎo)RT后腫瘤再生的新機(jī)制，如圖6所示。我們認(rèn)為，PMNMDSCs是輻照招募的主要亞型，而不是MMDSCs。在廣泛的免疫抑制機(jī)制中，ARG1的上調(diào)和激活是PMNMDSCs在放療后抑制CD8T細(xì)胞的主要機(jī)制。為了克服PMNMDSCs引起的免疫抑制，我們提出并證明，sildenafil和RT聯(lián)合使用降低了PMNMDSCs在TME內(nèi)的募集和免疫抑制作用，激活了CD8T細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)延遲。綜上所述，我們的研究結(jié)果為緩解免疫抑制TME以提高RT治療效果提供了一種新的解決方案。雖然所有這些結(jié)果都是在LLC小鼠模型中進(jìn)行的，但同樣的機(jī)制是否適用于其他腫瘤模型尚不清楚。此外，在不同的輻射方案下，MDSCs及其亞型如何影響TME仍未確定。因此，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步的研究來(lái)解決。